在轉(zhuǎn)基因和敲除研究中，維持多能性對(duì)利用小鼠胚胎干(ES)細(xì)胞至關(guān)重要。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多因子可以影響ES細(xì)胞的多能性,其中之一就表現(xiàn)在白血病抑制因子（LIF）對(duì)ES細(xì)胞培養(yǎng)的影響。關(guān)于抑瘤素M（OSM）能補(bǔ)償LIF在ES細(xì)胞培養(yǎng)中的作用，對(duì)此存在不一致的報(bào)道。一些研究提示在維持ES細(xì)胞多能性方面，OSM不如LIF有效。然而，其他研究發(fā)現(xiàn)它們是等效的。在本研究中，我們證明在維持ES細(xì)胞多能性上，人OSM擁有與小鼠LIF相類似的功效，包括長(zhǎng)期（超過10天）維持多能性、體外分化的能力、活化STAT3的能力和種系傳遞能力。我們的研究提示OSM可能是在早期胚胎發(fā)育中發(fā)揮作用的另一種因子，并且在小鼠ES細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，OSM可以被用作LIF的替代物。

抑瘤素M維持未分化ES細(xì)胞的形態(tài)

圖1：LIF或OSM中長(zhǎng)期培養(yǎng)后的細(xì)胞形態(tài)比較。（圖A，C），細(xì)胞培養(yǎng)于103 U/mL的LIF中。（圖B，D），細(xì)胞培養(yǎng)于10 ng/mL的OSM中。圖A和圖B是生長(zhǎng)于輻射照過MEF細(xì)胞上的細(xì)胞，圖C和圖D是生長(zhǎng)于明膠包被平板上的細(xì)胞。

圖像攝于第6代，然而，細(xì)胞在OSM培養(yǎng)基中可以連續(xù)25代維持未分化形態(tài)。箭頭所指是具有未分化形態(tài)的ES細(xì)胞克隆。所有圖片在200倍鏡下拍攝。

材料和方法

細(xì)胞培養(yǎng)：CJ7 ES細(xì)胞系由Tom Gridley贈(zèng)予。高葡萄糖DMEM培養(yǎng)基另加15%胎牛血清（FBS），4 mM谷氨酰胺，10 μM ，1% MEM非必需氨基酸，每毫升50 IU青霉素，每毫升50 μg鏈霉素，和每毫升103 U的LIF （ESGRO；Chemicon，Temecula CA）或者10 ng/mL的抑瘤素M（R&D Systems，目錄#295-OM），以此培養(yǎng)ES細(xì)胞。細(xì)胞生長(zhǎng)于輻射照過的小鼠胚胎滋養(yǎng)細(xì)胞（MEFs）上或者0.1%明膠包被的平板上。細(xì)胞每?jī)商靷鞔淮巍?/p>

把106個(gè)細(xì)胞傳到含有10%FBS，每毫升50 IU青霉素，每毫升50 μg鏈霉素，4 mM谷氨酰胺和DMEM培養(yǎng)基的6孔組織培養(yǎng)皿中，以此制備類胚體（EBs）。用培養(yǎng)基沖洗培養(yǎng)皿，分離細(xì)胞團(tuán)。把細(xì)胞團(tuán)轉(zhuǎn)移至有蓋培
養(yǎng)皿，然后每天更換培養(yǎng)基。要進(jìn)行分化時(shí)，懸浮培養(yǎng)EBs 4至6天，然后轉(zhuǎn)移0.1%明膠包被的24孔板，讓細(xì)胞貼板生長(zhǎng)7天，再進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)或?yàn)镽T-PCR提取RNA。

RT-PCR：用RNAeasy試劑盒（Qiagen），根據(jù)產(chǎn)品說明書從未分化的ES細(xì)胞和分化的EBs中提取RNA。使用Superscript First-Strand Synthesis System（Invitrogen），根據(jù)產(chǎn)品說明書，500 ng RNA通過隨機(jī)六聚體引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。2 μL cDNA用作擴(kuò)增模板。所有引物在55℃下退火，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)。

免疫細(xì)胞化學(xué)：所用一抗（rtxh/mOct3/4；mxh/mSox2；gtxmNanog；mxβIIITubulin；mxhTroponinT和gtxhHNF3β）購于R&D Systems。細(xì)胞或EBs轉(zhuǎn)養(yǎng)到24孔板中的蓋玻片上。在室溫下用4%多聚甲醛固定細(xì)胞20分鐘，然后將細(xì)胞在含有1%BSA（PBA）的PBS中洗4次。用含有PBA溶解的0.1%Triton X-100的10%驢血清封閉細(xì)胞45分鐘。然后加入10 μg/mL的一抗，孵育3個(gè)小時(shí)，之后把細(xì)胞在PBA中清洗三次，每次洗5分鐘。然后，用5 μg/mL的NothernLightsTM557連接的二抗（R&D Systems）孵育細(xì)胞1個(gè)小時(shí)，然后如上清洗細(xì)胞。

STAT3活化水平：用Active STAT3 DuoSet IC試劑盒（R&D Systems）檢測(cè)STAT3的活化水平。根據(jù)試劑盒說明書，用生長(zhǎng)于或未生長(zhǎng)于MEFs上的未分化ES細(xì)胞制備細(xì)胞核提取物。用Bradford檢測(cè)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定量分析。STAT3活化水平根據(jù)產(chǎn)品說明書而確定，然后根據(jù)總蛋白水平進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。

小鼠嵌合體的生物試劑：所有程序由密西根大學(xué)動(dòng)物使用和照顧委員會(huì)批準(zhǔn)。根據(jù)國家研究委員會(huì)關(guān)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物照顧和使用指南概述的原則和程序?qū)?dòng)物提供照顧。在含有LIF或者OSM的培養(yǎng)基中連續(xù)傳代5次后，用胰蛋白酶處理細(xì)胞，然后將16個(gè)ES細(xì)胞顯微注射到囊胚中。囊胚取自與C57BL/6J X DBA/2J/F1雄小鼠（The Jackson Laboratory，Bar Harbor，ME）交配的超數(shù)排卵的C57BL/6NCrl雌小鼠（Charles River Laboratories，Wilmington，MA）。注射當(dāng)天，用標(biāo)準(zhǔn)方法把顯微注射的囊胚轉(zhuǎn)移到假孕的受體雌鼠體內(nèi)。用嵌合體與C57BI/6J雌鼠交配來檢測(cè)種系傳遞。

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