ELISA實驗：在ELISA實驗技術(shù)中的抗原抗體反應(yīng)

1. 抗體的結(jié)構(gòu)

抗體是能與抗原特異性結(jié)合的免疫球蛋白 (immunoglobulin,Ig)。Ig 分五類，即IgG、IgA 、IgM、IgD 和IgE。與免疫測定有關(guān)的Ig 主要為 IgG 和IgM。Ig 由兩個輕鏈(L)和兩個重鏈(H)的單體組成。Ig 的輕鏈?zhǔn)窍嗤?，?kappa;(kappa)和λ(Lambda )兩種型別。五類Ig 的重鏈結(jié)構(gòu)不同，這決定了它們的抗原性也不同。IgG 和IgM 的重鏈分別稱為γ(gamma )鏈和μ(mu )鏈。重鏈和輕鏈的 N 端的氨基酸排列順序因各種抗體而異，稱為可變區(qū)，分別用VH 和VL 表示。兩者構(gòu)成抗體的抗原結(jié)合部位，只與相應(yīng)的抗原決定簇匹配，發(fā)生特異性結(jié)合，是抗體專一性結(jié)合抗原的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

IgG 可被木瓜蛋白酶分解為三個區(qū)段，其中兩個相同的區(qū)段稱抗原結(jié)合片段(Fab )。每個Fab 都保存結(jié)合抗原的能力，但只有一個抗原結(jié)合位點，是單價的，與抗原結(jié)合后不出現(xiàn)凝集或沉淀。另一區(qū)段稱Fc 段，無抗體活性，但具有IgG *的抗原性。

IgG 可被胃蛋白酶分解為兩個片段，一個Fab 雙體，稱F(ab’)2，能和兩個相同的抗原結(jié)合;另一片段類似Fc，隨后被分解成小分子多肽，無生物活性。

IgM 是由五個單體組成的五聚體，含 10 個重鏈和10 個輕鏈，具有10 個抗原結(jié)合價，由于空間位置的影響，只表現(xiàn)為五個抗原結(jié)合價。IgM 分子量約為900000， IgG 分子量約為150000 。

機(jī)體被微生物感染后，先產(chǎn)生 IgM 抗體，然后產(chǎn)生IgG 抗體。經(jīng)過一段時間，IgM 抗體量逐漸減少而消失，而IgG 抗體可長期存在，在疾病*后可持續(xù)數(shù)年之久。IgM 抗體一般為保護(hù)性抗體具有免疫性。因此IgM 抗體的測定，對某些傳染病如甲型肝炎有較高的研究診斷價值。右圖為為甲型肝炎病科研血清中IgG 抗體和IgM 抗體出現(xiàn)的時間和水平。

2. 抗原抗體反應(yīng)

2.1 可逆性

Ag·Ab 的解離程度與K 值有關(guān)。高親和力抗體的抗原結(jié)合點與抗原的決定簇在空間構(gòu)型上非常適合，兩者結(jié)合牢固，不易解離。解離后的抗原或抗體均能保持原有的結(jié)構(gòu)和活性，因此可用親和層析法來提純抗原或抗體。在抗血清中，特異性的IgG 抗體僅占總IgG 中的極小部分。用親和層析法提取的特異性抗體，稱為親和層析純抗體，應(yīng)用于免疫測定中可得到更好的效果。

2.2 zui適比例

在恒定量的抗體中加入遞增量的抗原形成抗體復(fù)合物(沉淀)的量見圖1-4。曲線的高峰部分是抗原抗體比例zui合適的范圍，稱為等價帶(zone of equivalence )。在等價帶前后分別為抗體過剩帶和抗原過剩帶。

如果抗原或抗體極度過剩，則無沉淀物形成，在免疫測定中稱為帶現(xiàn)象(zone phenomenon )?？贵w過量稱為前帶(prezone)，抗原地過量稱為后帶(postzone)。在用免疫學(xué)方法測定抗原時，應(yīng)使反應(yīng)系統(tǒng)中有足夠的抗體量，否則測得的量會小于實際含量，甚至出現(xiàn)假陰性。

2.3 特異性

抗原抗體的結(jié)合實質(zhì)上只發(fā)生在抗原的抗原決定簇與抗體的抗原結(jié)合位點之間。由于兩者在化學(xué)結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)型上呈互補(bǔ)關(guān)系，所以抗原抗體反應(yīng)具有高度的特異性。例如乙肝病毒中的表面抗原( HBsAg )、e 抗原(HBeAg)和核心抗體(HBcAg)，隨來源于同一病毒，但僅與其相應(yīng)的抗體結(jié)合，而不與另外兩種抗體反應(yīng)?？乖贵w反應(yīng)的這種特異性使免疫測定能在一非常復(fù)雜的蛋白質(zhì)化合物(例如血清)中測定某一特定的物質(zhì)，而不需先分離待檢物。

但是這種特異性也不是的。假使兩種化合物有著部分相同的結(jié)構(gòu)，在抗原抗體反應(yīng)中可出現(xiàn)交叉反應(yīng)。例如：絨毛膜促性腺激素( hCG)和黃體生成激素(LH)均由α和β兩個亞單位組成，其結(jié)構(gòu)的不同處在β亞單位，而兩者的α亞單位是同類的。用hCG 免疫動物所得的抗血清中含有抗α-hCG 和抗β-hCG 兩種抗體，抗α-hCG 抗體將與LH 中的α酶位發(fā)生交叉反應(yīng)。在研究檢驗中，如用抗hCG 抗血清作為妊娠診斷試劑檢定尿液中hCG，只能用于hCG 濃度較高的試驗，否則婦女生理性排泄入尿液中的微量LH 將與之發(fā)生交叉反應(yīng)。因此在作為早孕診斷(敏感度應(yīng)達(dá)到50mIu/mlhCG )的實際中必須應(yīng)用只對hCG 特異的抗β-hCG，以避免與其它激素的交叉反應(yīng)的發(fā)生。

2.4 敏感性

在測定血清中某一物質(zhì)的含量時，化學(xué)比色法的敏感度為 mg/ml 水平，酶反應(yīng)測定法的敏感度約為5~10μg/ml，免疫測定中凝膠擴(kuò)散法和濁度法的敏感度與酶反應(yīng)法相仿。標(biāo)記的免疫測定的敏感度可提高數(shù)千倍，達(dá)ng/ml 水平。例如，用放射免疫測定法或酶免疫測定法測定HBsAg，其敏感度可達(dá)0.1ng /ml。

3. 免疫測定在研究檢驗中的應(yīng)用

由于各種抗原成份，包括小分子的半抗原，均可用以制備特異性的抗血清或單克隆抗體，利用此抗體作為試劑就可檢測標(biāo)本中相應(yīng)的抗原，因此免疫測定的應(yīng)用范圍極廣，在研究檢驗中可用于測定：

1) 體液中的各種蛋白質(zhì)，包括含量極少的蛋白質(zhì)如甲胎蛋白等。

2) 激素，包括小分子量的甾體激素等。

3) 抗生素和藥物。

4) 病原體抗原，HBsAg、HBeAg 等。

5) 另外，也可利用純化的抗原檢測標(biāo)本中的抗體，例如抗-HBs 等。

4.標(biāo)記的免疫測定

如上所述，免疫測定是一種很敏感的測定方法，抗原抗體反應(yīng)后直接測定形成的沉淀或濁度，敏感度可達(dá) 5~10μg/ml，但在研究檢驗中，某些待測物在標(biāo)本中的含量遠(yuǎn)低于這一水平，因此要尋找增加敏感度的方法。標(biāo)記的免疫測定是將檢測試劑中的抗原或抗體用可微量測定的物質(zhì)加以標(biāo)記，通過測定標(biāo)記物來提高敏感度。在放射免疫測定和酶免疫測定中，標(biāo)記物分別為放射性核素和酶，zui后用測定放射性和酶活力來計算待檢物的量，敏感度可比直接測定沉淀物提高數(shù)百至數(shù)千倍。在標(biāo)記免疫測定中，一般加入過量的標(biāo)記試劑以保證與待測物*反應(yīng)。以標(biāo)記抗體(Ab ※)檢測抗原(Ag)為例，反應(yīng)式如下：

Ag+ Ab※→ AgAb※+ Ab※

在反應(yīng)產(chǎn)物中有與Ag 結(jié)合的Ab※和游離和Ab※ ，如不將兩者分離而測定標(biāo)記物，測得的結(jié)果將為兩者之和。因此，游離標(biāo)記物與結(jié)合標(biāo)記物的分離是標(biāo)記免疫測定中的重要步驟?？刹捎枚喾N手段，固相載體是其中之一。如將抗原或抗體包被在固相載體上，然后再與標(biāo)記的抗原或抗體直接反應(yīng)，結(jié)合的標(biāo)記物被固定在載體上，而游離的標(biāo)記物留于溶液中。這樣可以通過洗滌將游離的Ab ※除去，結(jié)合標(biāo)記物的測定可在固相上進(jìn)行。

5.酶免疫測定

酶免疫測定(enzyme immunoassay )可分為均相(homogenous)和非均相(heterogenous )兩種類型。

在均相EIA 中可不需進(jìn)行游離的和結(jié)合的標(biāo)記物的分離而直接測定標(biāo)記物。例如在某種條件下，抗原抗體反應(yīng)后形成的酶標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物中的酶失去其對底物作用的活力，因而測出的酶活力直接反映游離的酶標(biāo)記物。均相EIA 在研究檢驗中較少應(yīng)用。非均相EIA 需*行游離的和結(jié)合的標(biāo)記物的分離。如前所述，固相載體可用作一種分離手段。這種固相酶免疫測定方法在1971 年zui初建立時稱為酶聯(lián)免疫吸附劑測定(enzyme linked immunosorbent assay )，簡稱ELISA ，在國內(nèi)有譯作酶聯(lián)免疫吸附試驗的，雖然含義不*確切，但已習(xí)用。

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