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BBT電泳緩沖液(pH8.6)如何正確使用

更新時間:2022-01-21      瀏覽次數(shù):2221

 BBT電泳緩沖液(pH8.6)如何正確使用


上海信帆生物供應BBT電泳緩沖液,可用于電泳實驗,醋酸纖維素薄膜實驗等,操作方便,質量穩(wěn)定!


本公司用于的電泳緩沖液,離子強度為0.075.操作時候請注意上樣緩沖液:所有泳道應使用相同的上樣緩沖液,以防止因離子強度不同造成條帶遷移率偏差。

醋酸纖維素薄膜電泳實驗操作注意事項:

1.首先,裁剪適量尺寸濾紙條來搭建濾紙橋,再將緩沖液倒入電泳槽,在醋酸纖維素薄膜無光澤面做好點樣標記。
2.然后,將該面在下浸入緩沖液約二十分鐘,在浸透*以后,取出吸取多余緩沖液的備用。
3.然后,用加樣器取適量蛋白樣品均勻加于點樣線處,最終形成一定寬度、粗細均勻的直線。
4.然后,將點樣端位于負極,無光澤面朝下,平整放于濾紙橋上,平衡完畢后,調節(jié)電壓并開始電泳。


其他注意事項:

1、醋酸纖維素薄膜的預處理
  市售醋酸纖維素薄膜均為干膜片,薄膜的浸潤與選膜是電泳成敗的重要關鍵之一。將干膜片漂浮于電極緩沖液表面,其目的是選擇膜片厚薄及均勻度,如漂浮15s—30s時,膜片吸水不均勻,則有白斑點或條紋,這提示膜片厚薄不勻,應舍去不用,以免造成電泳后區(qū)帶扭曲,界線不清,背景脫色困難,結果難以重復。由于醋酸纖維薄膜親水性比紙小,浸泡30min以上是保證膜片上有一定量的緩沖液,并使其恢復到原來多孔的網(wǎng)狀結構。最好是讓漂浮于緩沖液的薄膜吸滿緩沖液后自然下沉,這樣可將膜片上聚集的小氣泡趕著走。點樣時,應將膜片表面多余的緩沖液用濾紙吸去,以免緩沖液太多引起樣品擴散。但也不能吸得太干,太干則樣品不易進入薄膜的網(wǎng)孔內(nèi),而造成電泳起始點參差不齊,影響分離效果。吸水量以不干不濕為宜。為防止指紋感染,取膜時,應戴指套或用鑷子。
  
2、緩沖液的選擇   
醋酸纖維素薄膜電泳常選用 BBT電泳緩沖液(pH8.6),其濃度為0.05mol/L—0.09mol/L。選擇何種濃度與樣品及薄膜的薄厚有關。選擇時,先初步定下某一濃度,如電泳槽兩極之間的膜長度為8 cm—10cm,則需電壓25V/cm膜長,電流強度為0.4mA/cm—0.5mA/cm膜寬。當電泳達不到或超過這個值時,則應增加緩沖液濃度或進行稀釋。緩沖液濃度過低,則區(qū)帶泳動速度快,并由于擴散變寬;緩沖液濃度過高,則區(qū)帶泳動速度慢,區(qū)帶分布過于集中不易分辨。  
 
3、加樣量
  加樣品的多少與電泳條件、樣品的性質、染色方法與檢測手段靈敏度密切相關。作為一般原則,檢測方法越靈敏,加樣量則越少,對分離更有利。如加樣量過大,則電泳后區(qū)帶分離不清楚,甚至互相干擾,染色也較費時。如電泳后用洗脫法定量時,每厘米加樣線上需加樣品0.1μl—0.5μl約相當于5μg—1000μg蛋白。血清蛋白常規(guī)電泳分離時,每厘米加樣線加樣量不超過1μl,相當于60μg—80μg的蛋白質。但糖蛋白和脂蛋白電泳時,加樣量則應多些。對每種樣品加樣量均應先作預實驗加以選擇。
  點樣好壞是獲得理想圖譜的重要環(huán)節(jié)之一,以印章法加樣時,動作應輕、穩(wěn),用力不能太重,以免將薄膜弄壞或印出凹陷而影響電泳區(qū)帶分離效果。   
4、電量的選擇
  電泳過程應選擇合適的電流強度,一般電流強度為0.4mA/cm—0.5mA/cm寬膜為宜。電流強度高,尤其在溫度較高的環(huán)境中,可引起蛋白質變性或由于熱效應引起緩沖液中水分蒸發(fā),使緩沖液濃度增加,造成膜片干涸。電流過低,則樣品泳動速度慢且易擴散。
5、染色液的選擇
  對醋酸纖維素薄膜電泳后染色應根據(jù)樣品的特點加以選擇。其原則是染料對被分離樣品有較強的著色力,背景易脫色;應盡量采用水溶性染料,不宜選擇醇溶性染料,以免引起醋酸纖維素膜溶解。
  應控制染色時間。時間長,薄膜底色深不易脫去;時間短,著色淺不宜區(qū)分,或造成條帶染色不均,必要時可進行復染。  
 
6、透明及保存
  透明液應臨用前配制,以免冰乙酸及乙醇揮發(fā)影響透明效果。這些試劑最好選用分析純。透明前,薄膜應*干燥。透明時間應掌握好,如在透明乙液中浸泡時間太長則薄膜溶解,太短則透明度不佳。
  透明后的薄膜*干燥后才浸入石蠟中,使薄膜軟化。如有水,則液體石蠟不易浸入,薄膜不易平展。宜。


 BBT電泳緩沖液(pH8.6)如何正確使用



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