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WB實(shí)驗(yàn)代測基本過程介紹

更新時(shí)間:2019-04-27      瀏覽次數(shù):937
  WB實(shí)驗(yàn)代測基本過程介紹
  WB實(shí)驗(yàn)代測,客戶只需要提供樣本,其余所有試劑均由我司提供,下面我們就做WB實(shí)驗(yàn)代測的原理以及大致需要的試劑做了一個(gè)匯總。western免疫印跡是將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上,然后利用抗體進(jìn)行檢測。對已知表達(dá)蛋白,可用相應(yīng)抗體作為一抗進(jìn)行檢測,對新基因的表達(dá)產(chǎn)物,可通過融合部分的抗體檢測。
  1、獲取細(xì)胞或組織裂解物
  1)根據(jù)檢測蛋白的位置選擇合適的裂解buffer;
  2)選擇合適的蛋白酶抑制劑,避免蛋白降解,從而保證檢測的準(zhǔn)確性。
  2、蛋白定量
  3、電泳分離蛋白質(zhì)
  4、轉(zhuǎn)膜:根據(jù)不同的檢測目的和待測蛋白的特性,選擇合適的膜類型。
  5、封閉:去掉膜上多余的非特異性結(jié)合位點(diǎn),降低背景。
  6、一抗孵育一抗的選擇成功與否,是整個(gè)WB實(shí)驗(yàn)代測成功的關(guān)鍵,選擇一抗有以下幾個(gè)注意點(diǎn):
  1)選擇適合檢測標(biāo)本種屬的一抗;
  2)選擇適用于WB實(shí)驗(yàn)方法的一抗;
  3)選擇單克隆抗體或者經(jīng)過親和純化的多克隆抗體。
  7、二抗孵育:孵育條件一般為室溫1-2小時(shí)。
  8、底物孵育:選擇顯色或者化學(xué)發(fā)光底物。一般傾向于化學(xué)發(fā)光,靈敏度高且背景低,節(jié)省抗體用量。
  9、結(jié)果分析和檢測:凝膠成像系統(tǒng)檢測或者暗室曝光到膠片。
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